分享一篇发表在JACS上的文章，文章的题目是“Kinetic Resolution of Epimeric Proteins Enables Stereoselective Chemical Mutagenesis”，通讯作者为伦敦国王学院的Manuel M. Müller，主要研究方向是开发和应用化学生物学工具来阐明蛋白质如何受翻译后修饰调控。
通过脱氢丙氨酸（Dha）进行化学诱变是一种进行蛋白质功能化的强大且常用的方法。由于Dha独特的反应活性，其可以实现多种碳杂键以及碳碳键的生物相容性组装，以允许位点特异性地安装非天然官能团以及翻译后修饰。这对开发新的多功能蛋白质以及剖析内源性PTMs在生物学和疾病中的作用有着重要的帮助。然而，Dha化学诱变有一个主要缺点，即缺乏立体选择性，因此往往产生差向异构体产物，这对PTMs功能的定量生物物理学检测造成了困难，也阻碍了Dha在药物生物偶联物合成中的应用。针对以上问题，在本文中作者开发了一种化学酶编辑方法，通过使用来自蜡样芽孢杆菌的碱性D-肽酶（AD-P）对Dha反应后生成的D型异构体进行选择性水解，以实现差向异构体的动力学拆分。这里作者首先选择了组蛋白H3作为模型系统来验证这一方法的可行性。通过将Lys9突变为Cys，并使用2,5-二溴乙二酰胺（DBHDA）将Cys转化为DHA构建了H3K9Dha模型。考虑到AD-P对D-Phe的固有选择性，作者使用苄硫醇对Dha进行了官能团化，并使用AD-P进行孵育。结果表明在加入有活性的AD-P后SDS-PAGE中出现了一个位于H3下方的新条带，HRMS分析也表明产生了一个质量为14167 Da的新物种，其分子量与N端切除9个氨基酸的H3一致，证实了AD-P对D型异构体的选择性剪切活性。随后作者探索了AD-P对不同非天然氨基酸的底物范围。这里作者选择了一系列具有不同几何形状与电子特性的疏水侧链，包括环己基硫醇，苯硫酚以及丙烯基硫醇等。质谱结果表明AD-P均能以接近50%的产率对所有疏水差向异构体蛋白进行拆分，而对D-二甲基赖氨酸类似物，D-乙酰赖氨酸类似物等长链亲水非天然氨基酸的拆分效果则较差。综合以上结果表明AD-P对多种疏水残基具有良好的底物相容性，但对较长侧链和亲水残基仍存在一定限制。最后作者又进一步对AD-P的蛋白底物范围进行了探索。这里作者选择了绿色荧光蛋白（GFP），质量控制蛋白SGTA的底物识别结构域，Ddx4蛋白的内在无序区作为基准进行检测。结果表明AD-P对上述蛋白的多种含不同非天然氨基酸的变体均可实现有效拆分，表明AD-P不仅对非天然氨基酸具有较广的底物范围，对不同蛋白底物亦具有良好的相容性。总而言之，本文开发了一种化学酶编辑方法，通过AD-P对D型异构体的选择性水解，解决了Dha化学诱变缺乏立体选择性的问题，为蛋白质的立体选择性化学改造提供了新的工具。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c07103文章引用：10.1021/jacs.4c07103
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