分享一篇发表在JACS上的文章：De Novo Glycan Display on Cell Surfaces Using HaloTag: Visualizing the Effect of the Galectin Lattice on the Lateral Diffusion and Extracellular Vesicle Loading of Glycosylated Membrane Proteins，通讯作者是大阪大学的Koichi Fukase，Kazuya Kabayama以及Yoshiyuki Manabe。其中Koichi Fukase课题组主要研究糖类的合成及其先天免疫活性。

细胞表面的糖衣能够调控细胞的多种生命过程，为了精确地对特定糖结构的功能展开研究，研究者们此前已经开发了通过酶法、化学方法以及化学酶法的手段来引入特定的糖结构，但目前的方法大多仅对糖结构存在选择性，而对底物蛋白没有选择性，因此本文作者希望结合HaloTag技术来对特定蛋白上的糖结构进行更加精准的编辑，从而对特定糖结构的功能进行研究。

作者首先合成了7种不同结构的N糖配体，它们均在还原末端含有荧光基团用于后续成像，以及用来与HaloTag连接的烷基氯。随后作者在Hela细胞中表达融合了HaloTag并被GPI锚定的靶蛋白，并发现加入7种糖配体后均能够成功在靶蛋白上实现连接。随后作者使用能够识别特定糖型的lectin对插入的糖进行检测，并发现识别平分型GlcNAc的PHA-E4的确能够成功识别他们插入的含平分型GlcNAc的糖配体，而不识别其它结构的糖配体。识别核心岩藻糖的PhoSL以及识别唾液酸的MAM, SSA后续也被证实能够识别插入后对应的糖结构。

成功构建了目标蛋白上特定N糖结构的编辑系统后，作者对特定糖结构的功能展开研究。由于此前有报道Gal-3蛋白与N糖的结合能力会随着唾液酸的引入而下降，且糖胺的形成会增强这种结合力，因此作者用FRAP成像技术检测了不同糖结构的糖蛋白在经过Gal-3处理后光漂白恢复速率的变化，并发现糖胺结构的糖配体的确具有最大的抑制蛋白横向扩散的能力。后续的单荧光分子成像实验结果得到了类似的结论，说明作者的方法成功实现了对不同糖结构在单一蛋白上的功能进行区分。

随后作者又将这一技术用于研究不同N糖结构对膜蛋白进入胞外囊泡能力的影响中。作者对蛋白进行不同糖配体的标记，随后收集细胞外泌体进行检测，他们发现额外添加了半乳糖末端的N糖对于细胞进入外泌体具有促进作用，说明不同的N糖结构可能能够调控膜蛋白向外泌体的转运。

总之，这篇文章通过HaloTag实现了对目标蛋白上特定化学结构的糖修饰的引入，能够用于精确地研究特定糖修饰的功能。

本文作者：LDY

责任编辑：ZF

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02040

DOI：10.1021/jacs.4c02040