分享一篇近期发表在ACS Polym. Au上的研究进展，题为Ampholytic Peptides Consisting of an Alternating Lysine/Glutamic Acid Sequence for the Simultaneous Formation of Polyion Complex Vesicles。这篇文章的通讯作者是日本京都大学的Kousuke Tsuchiya和Keiji Numata。
通过正负电荷物种之间的静电相互作用，生物大分子与合成高分子可以自组装形成具有独特尺寸和形态的复合物，从而产生特定功能。以生命系统为例，蛋白质和多肽中的带电氨基酸残基(赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等)通常起着多种关键作用，包括作为pH响应性和酶响应性行为的作用中心，以及稳定结构等。 赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)残基共存可以赋予蛋白质和多肽两性特征以及特定功能。例如，研究表明伴侣蛋白的内部序列可以抵抗与靶蛋白的非特异性相互作用，可能原因是其内表面含有丰富的Lys和Glu残基。受该发现启发，研究人员开发了具有Lys和Glu交替序列的合成多肽，用作防污涂层材料。 前期工作中，作者以及其他团队共同开发了一种化学酶促多肽合成方法，即通过蛋白酶介导下氨基酸酯单体的反复氨解反应来合成多肽(Chem. Commun. 2013, 49, 385-387)。这种酶促合成方法适用于合成具有周期性序列的多肽，具有环境友好性，立体选择性和区域选择性等优点。本文中，作者采用这种方法合成了由交替Lys-Glu二肽序列组成的多肽，并且发现修饰上寡聚乙二醇的交替序列肽可以通过静电相互作用自发组装成囊泡颗粒(图1)。图1. Lys-Glu交替序列肽的自组装现象(a)与合成路线示意图(b) 选择合适的蛋白酶和底物是控制酶促合成方法的两个重要因素。首先，作者选择了木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作为Lys-Glu二肽单体酶促聚合反应的代表性酶，因为此前工作中作者已经证明木瓜蛋白酶可以催化Lys酯和Glu酯单体的均聚反应，而胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸具有高亲和力。 另外，作者合成了LysGlu(OEt)-OEt和Lys(Z)Glu(OEt)-OEt两种二肽乙酯型单体，其中Z代表Lys残基侧链上的苄氧羰基保护基团。两种蛋白酶和两种单体的综合酶促聚合反应结果如表1所示。结果表明，LysGlu(OEt)-OEt单体在两种酶催化下的产率都很低，这可能是单体或聚合产物发生了转酰胺反应或水解副反应，导致形成了Glu残基富集的白色沉淀状多肽产物以及Lys残基富集的水溶性多肽产物(runs 1-2)。而Lys(Z)Glu(OEt)-OEt单体在蛋白酶催化下的反应产率明显提高，尤其是在胰蛋白酶催化下(runs 3-5)。表1. Lys-Glu二肽单体酯单体的化学酶促聚合 基于MALDI-TOF MS谱图，作者进一步研究了不同蛋白酶催化下多肽产物的序列结构(图2)。结果表明，Lys(Z)Glu(OEt)-OEt单体在木瓜蛋白酶催化下所得产物同时含有Lys-Glu二肽交替序列产物以及相应额外插入或缺失Glu残基的无规序列产物，表明聚合过程可能发生了类似的转酰胺化或水解副反应(图2a)。而Lys(Z)Glu(OEt)-OEt单体在胰蛋白酶催化下所得产物仅含有Lys-Glu二肽交替序列产物，表明胰蛋白酶可以更好地识别Lys-Glu二肽单体序列进而发生交替聚合反应(图2b)。 作者依次用HBr和NaOH溶液处理无规序列产物与交替序列多肽产物，得到了具有未保护侧基的相应产物，分别称为polyKEran和polyKEalt。CD光谱结果表明，polyKEalt在不同pH下均主要采取规卷曲构象(图3a)，而polyKEran在不同pH下均主要采取β-折叠构象，且摩尔椭圆度明显低于polyKEalt。图3. 不同pH下的polyKEran和polyKEalt的CD光谱 随后，作者合成了N端修饰四聚乙二醇(TEG)链的polyKEalt产物，称为TEG-b-polyKEalt(图4a)。DLS结果表明，TEG-b-polyKEalt在超纯水中可以形成100-200 nm的组装体，并且其尺寸在24 h内几乎保持不变(图4b)。FE-SEM图像表明，TEG-b-polyKEalt组装体具有均匀的球形结构以及直径约为100 nm的空腔，表明形成了囊泡结构(图4c-d)。为研究交替Lys-Glu序列对组装结构的影响，作者还合成了相应具有无规序列结构的TEG-b-polyKEran。AFM图像表明，TEG-b-polyKEalt能够形成100-200 nm的球形组装体(图4e)，而TEG-b-polyKEran则会形成无序组装体以及尺寸分布更宽的球形组装体(图4f)。图4. polyKEalt的TEG修饰路线以及相关表征示意图 最后，作者以黄色荧光蛋白Citrine为模型蛋白，研究了TEG-b-polyKEalt包封功能蛋白的能力(图5a)。荧光关联光谱(FCS)结果表明，当TEG-b-polyKEalt存在时，Citrine的自相关函数G(t)拟合曲线具有更高的扩散时间，表明Citrine被成功包封在TEG-b-polyKEalt中。图5. TEG-b-polyKEalt囊泡封装蛋白质 总的来说，作者通过化学酶促聚合方法成功合成了含有交替Lys-Glu二肽序列的两性多肽，并且证明其四聚乙二醇修饰物可以自组装形成囊泡结构，以及包封黄色荧光蛋白Citrine，有望用于药物递送和纳米反应器等领域。DOI: 10.1021/acspolymersau.4c00029Link: https://doi.org/10.1021/acspolymersau.4c00029
目前评论：0